一、实验原理

植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。

二、实验目的

植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。

三、实验材料及准备

1．分离材料：梨黑斑病(Alternaria kikuchiana)，柿树圆斑病(Pestnlotia sp)及杉木炭疽病(Glomerella cingolata)新发病的病叶；杨树烂皮病(Cytospora chrysosperma)国槐腐烂病(Dothiorella sp.)的带有新病斑的枝条；油松种子。

2．分离用具(每小组为单位)

酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿(Φ9cm)24套，小烧杯(5ml)4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个(内放脱脂棉球)0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶(60ml)1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。

四、实验方法及步骤

(一)分离前的准备工作

1．工作环境的清洁和消毒

分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台(超净工作台)上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒(常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟)。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。

2．分离用具的消毒

凡是和分离材料接触的器皿(刀、剪、镊、针等)都要随时(至少在使用时)保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次(刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火)。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。

3．分离材料的选择

用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。